Hipótesis de la duplicación del ADN

• Hipótesis semiconservativa: formulada por Watson y Crick. En una doble hélice cada hebra servirá de molde y, mediante la complementariedad de bases, se formará una hebra copia de cada hebra molde, quedando al final dos dobles hélices formadas por una hebra antigua (molde) y una hebra nueva (copia). En 1957, experimentos realizados por Meselson y Stahl confirmaron esta hipótesis.
• Hipótesis conservativa: tras la duplicación quedan dos hebras antiguas y dos hebras nuevas formando una doble hélice.
• Hipótesis dispersa: se propone que las hebras están formadas por fragmentos distintos de ADN antiguo y ADN recién sintetizado.

El crecimiento de las nuevas hebras

• La ADN-polimerasa:

  El estudio in vitro de la duplicación del ADN fue posible gracias al aislamiento de la enzima ADN-polimerasa por Kornberg. Esta enzima es incapaz de iniciar una cadena de novo; requiere la presencia de un extremo libre del carbono 3' de un nucleótido, para poder ir añadiendo los nucleótidos nuevos. Este extremo 3' libre lo aporta el cebador o «primer», que es una porción pequeña de nucleótidos complementaria al extremo de la cadena patrón. Por tanto, la cadena naciente siempre crecerá en el sentido 5'®3'. El primer nucleótido de la cadena nueva tiene un extremo 5' libre; se irán añadiendo nucleótidos a los extremos 3' libre y se irán formando los enlaces fosfodiester 3'®5', de forma que el último nucleótido tendrá libre el carbono 3'.

  Los nucleótidos se añadirán siguiendo las reglas de la complementariedad de bases, de manera que la nueva hebra sintetizada será antiparalela y complementaria a la patrón.
• La duplicación del ADN in vivo:

  Estudios realizados con bacterias comprobaron que el cromosoma bacteriano tenía un origen de replicación, un punto en el ADN circular donde se iniciaba la síntesis de las hebras nuevas. Este punto se encontraba en una burbuja de replicación, donde se abría la doble hélice, y formaba lo que se denominaron las horquillas de replicación.

  En el mecanismo de duplicación in vivo surgían dos dilemas: ¿cómo podía la ADN-polimerasa iniciar la polimerización sin cebador? Y si la ADN-polimerasa sólo añadía nucleótidos en la dirección 5'®3', ¿cómo se explicaba el crecimiento, en sentido 3'®5', de una de las hebras de la horquilla de replicación?

  La solución la dio Okazaki: encontró fragmentos de mil a dos mil nucleótidos de ADN y unos cincuenta nucleótidos de ARN, que se añadían discontinuamente sobre la hebra patrón. A medida que se abría la horquilla de replicación se iniciaba la síntesis de un nuevo fragmento de Okazaki. Una hebra de la horquilla se copiaba de forma continua en dirección 5'®3' y la otra lo hacía de forma discontinua, mediante los fragmentos de Okazaki, también dirección 5'®3'. Los nucleótidos de ARN eran añadidos por la ARNpolimerasa, enzima que no precisa cebador, y luego la ADN-polimerasa iba incorporando los desoxinucleótidos, sobre la hebra patrón.

Mecanismo de duplicación del ADN en bacterias.

Mecanismos de duplicación del ADN

Aunque existen algunas diferencias el proceso es básicamente igual en bacterias y en eucariotas:

• La secuencia de nucleótidos en el origen de replicación del ADN actúa como señal de iniciación.
• La enzima helicasa separa las dos hebras de la doble hélice para que sirvan de molde. El desenrollamiento de la hélice da lugar al superenrollamiento en los extremos de la horquilla de replicación, actuando entonces las enzimas topoisomerasas que liberan esta tensión. La topoisomerasa I corta una hebra y la topoisomerasa II (denominada girasa en E. coli) las dos. Una vez liberada la tensión vuelven a sellar la doble hélice.
• Mientras se separan las dos hebras se van uniendo las proteínas estabilizadoras (SSB), de forma que se mantengan separadas ambas hebras y se estabilice la horquilla de replicación.
• El proceso de duplicación es bidireccional; hay dos horquillas de replicación por cada burbuja de replicación.
• La primasa (una ARN-polimerasa) sintetiza los fragmentos de ARN que sirven de cebador (primer) para la ADN-polimerasa.
• La ADN-polimerasa III incorpora en dirección 5'®3' los nucleótidos, formando una nueva hebra de crecimiento continuo denominada hebra conductora.
• Sobre la otra hebra antiparalela, primero, a unos mil nucleótidos del origen de replicación, se sintetizarán unos cincuenta nucleótidos de ARN que servirán para que la ADN-polimerasa III incorpore los desoxinucleótidos, formándose los fragmentos de Okazaki a medida que se va abriendo la horquilla. Una vez formados, la ADN-polimerasa I, gracias a su función exonucleasa, irá eliminando los tramos de ARN y los irá rellenando con ADN, sintetizados gracias a su actividad polimerasa.
• Finalmente interviene la ADN-ligasa, que empalma entre sí los distintos fragmentos de la hebra de crecimiento discontinuo, denominada hebra retardada.